Crispr: битва титанов и новая надежда

Превращение свиней в доноров органов

На протяжении десятилетий ученые обсуждали спорную идею о том, что животные могут быть донорами органов. Предыдущие попытки трансплантировать животные органы в человека заканчивались неудачей – иммунная система человека отвергала чужеродные ткани. (Первая трансплантация сердца прошла в 1964 году, ученые пытались пересадить сердце шимпанзе. Пациент умер через два часа). Еще одно препятствие – вероятность попадания инфекций.

Исследователи считают, что CRISPR может решить две эти проблемы.

Компания eGenesis при помощи CRISPR хочет сделать свиней подходящими донорами для людей. Многие свиные органы, например, сердце и почки, похожи на человеческие по размеру. Исследователи использовали технологию для устранения семьи вирусов, обнаруженных в ДНК свиньи, которые могли бы передаться человеку во время трансплантации. Эти вирусы, известные как эндогенные ретровирусы, могут перепрыгивать из клеток свиней в клетки человека и случайным образом интегрироваться в человеческий геном. На данный момент компания произвела десятки безвирусных свиней.

При помощи технологии организация также модифицирует гены, вовлеченные в иммунную систему, чтобы предотвратить вероятность отвержения органов. Тем не менее, пересадка органов генномодифицированной свиньи, скорее всего, пройдет еще нескоро.

Фото: PopMech

Генетическая «золотая лихорадка»

Оставался лишь вопрос времени, прежде чем эта техника выйдет за рамки академических кругов, и в 2015 году ряд компаний инвестировали в технологию CRISPR. Сначала это был фармацевтический тяжеловес Novartis, который подписал два отдельных контракта со стартапами по редактированию генов Intellia Therapeutics и Caribou Biosciences. Гигант планирует использовать CRISPR для инженерии иммунных клеток и стволовых клеток крови, а также для поиска лекарств.

Всего через несколько недель после Novartis другой производитель медикаментов AstraZeneca заключил четыре сделки с Wellcome Trust Sanger Institute, Innovative Genomics Initiative, институтами Брода и Уайтхэда в Массачусетсе и Thermo Fisher Scientific. В дополнение к уже созданной программе CRISPR, эта технология будет определять и утверждать новые цели в доклинических моделях по целому ряду областей заболеваний.

Затем иммунотерапевтическая фирма Juno Therapeutics пожала руку стартапу редактирования генов Editas и занялась созданием противораковой иммунной клеточной терапии; Vertex Pharmaceuticals и Crispr Therapeutics, другой стартап, заключил соглашение на 2,9 миллиарда долларов; Regeneron Pharmaceuticals образовал лицензионное соглашение с ERS Genomics, которой принадлежат права на интеллектуальную собственность CRISPR Эммануэля Шарпантье, одного из создателей CRISPR. Не только фармацевты отметились в этом деле, научная компания DuPont образовала союзы с Университетом Вильнюса и Caribou Biosciences, имея определенный интерес в выведении растений и сельскохозяйственном применении.

Помимо этих сделок, наблюдался рост инвестиционных потоков в стартапах, которые нацелены коммерциализировать технологию CRISPR и связанные с ней продукты, как в фармацевтике, так и в других сферах. Caribou, основанная пионером CRISPR Дженнифер Дудной, привлекла 15 миллионов долларов; Crispr Therapeutics, созданная Шарпантье, привлекла 89 миллионов долларов с апреля 2014 года, плюс 105 миллионов за счет сделки с Vertex; Editas, основанная текущим держателем патента Crispr Фэн Чжанем, привлекла свыше 160 миллионов долларов.

Хотя это только начало, аналитики считают, что эта технология станет революционной для заинтересованных компаний. «Тот факт, что одна только сделка была оценена в 2,6 миллиарда долларов, говорит о размерах, которых может достичь технология», говорит Аннетт Брейндл, старший научный редактор Thomson Reuters BioWorld.

AstraZeneca интересует не только коммерческий потенциал CRISPR. В компании считают, что эта технология предложит мощное решение для научно-исследовательских и опытных проблем, которые тормозят фармацевтическую промышленность, говорит пресс-секретарь компании Карен Бирмингем. От ускорения идентификации и валидации новых терапевтических мишеней, до создания улучшенных животных моделей человеческих заболеваний в кратчайшие сроки и снижения числа неудачных продуктов, CRIPR сможет сократить миллионы расходов на R&D и ускорить поиск лекарств. «В конечном счете за счет использования CRISPR мы надеемся увеличить продуктивность фармацевтического R&D процесса».

Аналогичным образом, в сельскохозяйственном пространстве CRISPR обещает стать решением для многих производителей, которые хотят больше точности в сжатые сроки, говорит Нил Гаттерсон, вице-президент по R&D в DuPont Pioneer. В настоящее время срок развития сельскохозяйственных продуктов варьируется от 10 до 20 лет, что усложняет прогнозирование урожая и накладывает определенные ограничения на реакцию. «Редактирование генома Crispr-Cas9 позволит нам быстрее отвечать на потребности фермеров и повысит нашу способность выращивать высококачественный урожай с таким же или меньшим количеством ресурсов».

CRISPR на ферме

Иллюстрация: Sébastien Thibault

Пока Андерсон и остальные пытаются модифицировать ДНК в клетках человека, другие нацеливаются на сельские культуры и скот. До принятия техник генного редактирования довольствовались вставкой гена в геном в случайных позициях, вместе с последовательностями из бактерий, вирусов или других организмов, которые управляли экспрессией этого гена. Но такой процесс был неэффективен, и к тому же всегда находились критики, кому приходилось не по нраву смешивание ДНК от различных видов или у кого возникали опасения насчёт возможного нарушения работы других генов вследствие дефектного встраивания. Более того, получение генетически модифицированных культур, утверждённых для употребления, – это такая сложная и дорогостоящая процедура, что большинство из них – это такие значительные в рыночном отношении культуры, как кукуруза и соевые бобы.

Благодаря CRISPR можно ожидать изменения ситуации: простота и низкая стоимость могут сделать редактирование генома пригодной опцией для более мелких, особых культур, а также для животных. В последние несколько лет исследователи применяли этот метод для выведения маленьких хрюшек и пшеницы с рисом, устойчивых к болезням. Также они достигли прогресса в создании безрогого скота, резистентных к заболеваниям коз и обогащённых витаминами сладких апельсинов. Доудна считает, что её список CRISPR-модифицированных организмов продолжит пополняться. «У нас есть прекрасная возможность рассмотреть проводящиеся эксперименты или технические методики на тех растениях, которые не так важны с коммерческой точки зрения, но очень интересны для научной перспективы – или для овощных садов», — говорит она.

Способность CRISPR достаточно точно редактировать существующие ДНК-последовательности способствует более точным модификациям, но в то же время мешает орган контроля, надзора и регулирования и фермерам идентифицировать модифицированный организм после его выпуска. «Из-за генного редактирования у нас больше нет возможности отслеживать генно-инженерные продукты», — говорит Дженнифер Казма (Jennifer Kuzma) из университета штата Северная Каролина. «Будет непросто выявить, мутировало ли что-то естественным путём или с применением технологии».

Это настоящий звонок тревоги для противников генной модификации сельскохозяйственных культур, и это непростая проблема для стран, пытающихся разработать методы регулирования генного редактирования растений и животных.

В Соединённых Штатах Управлению по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA) ещё только предстоит утвердить список всех генетически модифицированных животных, разрешённых для потребления человеком, и пока ещё неясно, как именно будут обращаться с такими животными.

Согласно действующим законам не все культуры, созданные путём геномного редактирования, потребуют регулирования со стороны Министерства сельского хозяйства США (см. Nature). Но в мае Министерство начало искать возможные пути улучшения методов регулирования генетически модифицированных культур – это шаг, который многие восприняли как знак того, что агентство проводит переоценку своих законов в свете таких технологий, как CRISPR. «Окно разбито», — говорит Казма. — «Всё, что проходит через окно, остаётся на виду. Но сам факт того, что оно именно разбито, весьма интересен».

С помощью CRISPR можно быстро и просто диагностировать многие заболевания

Сергей Коленов, Хайтек+

Компания Mammoth Biosciences намерена сделать диагностику самых разных заболеваний – в том числе сложных в диагностике и смертельно опасных – простой и доступной. В случае успеха тесты от Mammoth позволят выявлять широкий спектр болезней – от папилломавирусов до малярии, а воспользоваться ими будет не сложнее, чем тестом на беременность.

Mammoth Biosciences была основана около года назад выпускниками Стэнфордского университета. Как сообщает Business Insider, команда решила использовать технологию CRISPR, которая обычно служит для удаления и замены дефектных генов, для диагностики различных заболеваний.

Комплексы CRISPR/Cas содержат гидовую РНК, которая позволяет им находить нужный генетический фрагмент. Соединив фермент с определенной РНК, можно настроить его на поиск нуклеотидных последовательностей, характерных для возбудителей различных болезней.

После того, как белок разрежет эту последовательность, прикрепленная к нему рецепторная молекула начнет светиться, что укажет на наличие заболевания.

Процесс позволит анализировать образцы мочи, слюны и крови без сложных приборов, которые обычно используются в диагностике, например, машин для ПЦР. Кроме того белковые комплексы CRISPR стабильны и просты в транспортировке, что сделает технологию доступной для широкого круга пациентов. Их даже можно нанести на тестовую полоску, а затем анализировать результаты с помощью камеры смартфона. Использовать такой тест будет не сложнее, чем тест на беременность, отмечают в Mammoth.

В разработке технологии помогла знаменитая Дженнифер Дудна, одна из пионеров CRISPR и руководитель научного совета компании.

Вместе с командой других исследователей она доказала, что белковые комплексы CRISPR/Cas12 и CRISPR/Cas13 эффективно диагностируют вирус папилломы человека, а также вирусы Зика, Денге и ряд других болезней.

Методики Mammoth Biosciences пока находятся на стадии разработки. В июле компания получила финансирование в размере $23 млн. Эти средства пойдут на дальнейшие исследования, а также подготовку клинических испытаний. Срок выхода технологии на рынок пока неизвестен.

Исследователи из США нашли способ сделать генное редактирование более эффективным и безопасным. Они поместили комплексы CRISPR внутрь вирусной оболочки, которая соединена с наночастицей металла и открывается под воздействием магнитного поля. Это позволяет запускать генное редактирование только в определенных органах и тканях.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru

Альтернатива Нобелевской премии. Или репетиция?

Премия Кавли вручается раз в два года за выдающиеся достижения в области астрофизики, нанотехнологий и нейробиологии. Основал ее в 2007 году Фред Кавли, американский филантроп норвежского происхождения, сделавший состояние на сенсорных датчиках для авиации. Кавли мечтал создать альтернативу Нобелевской премии — та, по его мнению, слишком консервативна и нетороплива, так что зачастую признание научных достижений получает не действующий ученый, а пенсионер. Соучредителями стали Норвежская академия наук и Министерство образования и исследований Норвегии. Выбор номинаций Кавли объяснил так: «Я решил поддержать три области науки: одна занимается самым большим, другая — самым маленьким, третья — самым сложным».

«Нанотехнологическую» премию Кавли 2018 года «за изобретение CRISPR-Cas9 — точного наноинструмента для редактирования ДНК, совершившего прорыв в области биологии, медицины и сельского хозяйства» получили Эммануэль Шарпентье (сейчас она работает в Институте инфекционной биологии Общества Макса Планка в Германии) и Дженнифер Дудна (Калифорнийский университет в Беркли, США), а также Виргиниюс Шикшнис из Вильнюсского университета. Денежные премии (общая сумма 1 млн долларов), медали и дипломы будут вручены лауреатам в Осло 4 сентября.

Открытие системы CRISPR-Cas9 и создание орудий для редактирования генома — заслуга десятков ученых. Подробности можно найти в эссе «Герои CRISPR» директора Института Брода Эрика Ландера (Cell, 2016, 164 (1), p. 18–28, полный текст, см. также русский пересказ на сайте «Биомолекула»); среди знакомых нам героев — Евгений Кунин и Константин Северинов с коллегами. Но главный приз — приоритет в практическом применении — мог достаться лишь немногим.

В августе 2012 года авторский коллектив под руководством Шарпентье и Дудны сообщил о применении системы CRISPR-Cas9 для редактирования генома (Science, 2012, V. 337, 6096, p. 816–821). А спустя всего месяц, в сентябре того же года, аналогичные результаты опубликовала группа, возглавляемая Шикшнисом (PNAS, 2012, 109 (39), E2579–E2586, полный текст). Вильнюсцы оказались вторыми не по своей вине, ранее в 2012 году они посылали статью на ту же тему в Cell, но статью отклонили без рассмотрения: большой журнал, ученые из маленькой страны… А заниматься CRISPR они начали не позднее 2007 года, в частности, именно они перенесли CRISPR-систему стрептококка в кишечную палочку. Первый автор той самой статьи в PNAS, Гедрюс Гасюнас, в 2016 году на вопрос корреспондента Nature о том, сильно ли его раздражает роль невоспетого героя, ответил философски: «Наука — рискованное поле деятельности, но, если вы хотите чего-то добиться, вы должны рисковать».

На самом деле все не так плохо: научное сообщество помнит об их заслугах, присуждение Шикшнису премии Кавли восприняло положительно, а до этого были и другие награды — например, в 2017 году Шикшнис и Шарпентье получили датскую премию Novo Nordisk фонда Novozymes в 3 млн датских крон (403 000 евро). Но СМИ в тонкости публикационной политики научных журналов не вдаются, их в сложившейся ситуации намного больше привлекают две умные и красивые женщины, блондинка Дженнифер и брюнетка Эммануэль. (Не хочется загадывать, но обе отлично смотрелись бы в Голубом зале стокгольмской ратуши и блистательно опровергли бы все эти инсинуации насчет присуждения нобелевских медалей только почтенным старичкам!)

А что Фэн Чжан из Института Брода, обычно упоминаемый вместе с Дудной и Шарпентье, но обойденный оргкомитетом премии Кавли? Группа под руководством Фэна Чжана опубликовалась позже — в феврале 2013 года (Science, 2013, 1231143). Зато в их работе технология была испытана на клетках млекопитающих — человека и мыши, что впоследствии оказалось ключевым для патентования.

Новое лечение рака и заболеваний крови

Внедрение CRISPR прямо в человека довольно рискованно, поэтому сейчас исследователи редактируют клетки вне тела, а затем вводят их обратно в пациентов.

В США в скором времени пройдет клиническое исследование, в котором примут участие 18 человек с такими заболеваниями, как множественная миелома, саркома и меланома. Ученые извлекут их иммунные клетки и при помощи CRISPR изменят их так, чтобы они могли атаковать раковые клетки. Отредактированные клетки введут обратно в пациентов.

Другая компания, CRISPR Therapeutics, планирует использовать CRISPR для лечения людей с бета-талассемией и серповидноклеточной анемией. Это два связанных заболевания, вызванных мутациями в одном и том же гене. Эти мутации влияют на способность человека вырабатывать гемоглобин – важнейший элемент крови, железосодержащий белок и основной компонент эритроцитов. Компания заявила, что начала набор пациентов с бета-талассемией для исследования в Германии. В США же пробное лечение больных серповидноклеточной анемией планируется на конец 2018 года.

В ходе исследований ученые будут извлекать стволовые клетки костного мозга пациентов, редактировать их, а затем вводить обратно.

Что такое CRISPR и CRISPR-Cas9?

CRISPR (от англ. — clustered regularly interspaced short palindromic repeats, что значит кластеризованные, регулярно распределенные короткие палиндромные повторы) — это специальные области бактериального генома, содержащие фрагменты ДНК паразитов (бактериофагов), которые ранее заражали эту группу бактерий. CRISPR позволяют бактериям обнаруживать и уничтожать чужеродную ДНК, тем самым защищаясь от инфекций. Генетические локусы CRISPR служат источниками криспр-РНК, которые могут узнавать чужеродные последовательности. Эти молекулы формируют комплексы с белками, способными разрезать ДНК, благодаря чему эти последовательности уничтожаются. Наиболее хорошо изученный CRISPR-комплекс включает ДНК-разрезающий белок Cas9.

Ученые изобрели способ модифицировать природный комплекс CRISPR-Cas9 и программировать его на узнавание практически любых желаемых последовательностей ДНК у человека, животных, растений или любых других организмов. После узнавания искомой последовательности CRISPR-редактор может разрезать ее или, в случае дополнительных модификаций системы, изменить активность близлежащих генов, повлиять на упаковку окружающей ДНК или просто послужить меткой для выбранного участка. Природные и модифицированные CRISPR-эффекторы — это точные, настраиваемые и простые в использовании инструменты, дающие огромные возможности для фундаментальных исследований, лечения генетических заболеваний, создания новых организмов с заданными свойствами, борьбы с вредителями.

Как изучали?

Параллельно, начиная с 2002 года, Эммануэль Шарпентье исследовала в Венском университете (Австрия) другую крайне враждебную человеку бактерию Streptococcus pyogenes. Каждый год она поражает миллионы людей, вызывая как довольно легко излечимые заболевания, вроде тонзиллита или импетиго, так и опасный сепсис, — причину отказа множества внутренних органов, часто приводящую к гибели пациента. Из-за этого Streptococcus pyogenes нередко называют «пожирателем плоти».

Исследования носили вполне практический характер: почему эта бактерия столь агрессивна? Как она становится устойчивой к применяемым против неё антибиотикам? И можно ли найти новый способ борьбы с ней? Для ответа на все эти вопросы требовалось понять молекулярные механизмы — как регулируется экспрессия и работа генов Streptococcus pyogenes.

Многие люди характеризуют Шарпентье как целеустремлённую, внимательную и тщательную исследовательницу. Другие говорят, что она всегда в поисках неожиданного. Сама же она часто повторяет девиз Луи Пастера: «Удача благоволит подготовленному уму». Стремление к новым открытиям и желание быть свободной и независимой направляли карьерную траекторию Шарпентье. Начиная с докторантуры в Институте Пастера в Париже, она жила в пяти странах, семи разных городах и работала в десяти научных учреждениях.

В своих неустанных поисках Шарпентье в 2009 году сменила уютную Вену на позицию в шведском Университете Умео, чтобы более подробно изучить активно участвующие в работе молекулярно-генетической машинерии молекулы РНК. Совместно с исследователями из Берлина ей удалось полностью описать РНК, обнаруженные в Streptococcus pyogenes. Полученные результаты поставили перед ней новые вопросы, так как один из вариантов молекулы РНК экспрессировался внутри бактерий в огромных количествах, однако его функции оставались неизвестными. Понятно было только то, что он как-то связан со необычным локусом CRISPR в бактериальном геноме.

Всё это заставило Шарпентье продолжить исследования именно в этом направлении. Тщательный анализ генетического кода показал, что часть исследуемой молекулы РНК комплементарна регулярно повторяющимся участкам локуса CRISPR, словно два кусочка пазла. Сама Шарпентье до этого момента не имела опыта работы с CRISPR, но под влиянием своей исследовательской группы согласилась детально прояснить механизмы этой системы.

Выяснилось, что для разрезания вирусной ДНК используется один из белков Cas — Cas9. Кроме того, Шарпентье показала, что та самая неизвестная молекула РНК имеет решающее значение. Она необходима для того, чтобы другая — очень длинная РНК, — созданная на основе последовательности CRISPR в геноме (crRNA), перешла в активную форму. Поэтому ранее загадочную РНК назвали tracrRNA (trans-activating crispr RNA). 

История

Ранние исследования Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster продемонстрировали крупномасштабные скрининги систематической потери функции (LOF), выполняемые посредством мутагенеза насыщения , демонстрируя потенциал этого подхода для характеристики генетических путей и идентификации генов с уникальными и важными функциями. Техника насыщающего мутагенеза позже была применена к другим организмам, например к рыбкам данио и мышам.

Целевые подходы к нокдауну генов появились в 1980-х годах с такими методами, как , и антисмысловые технологии .

К 2000 году технология РНК-интерференции (РНКи) превратилась в быстрый, простой и недорогой метод направленного нокдауна гена , который обычно использовался для изучения функции генов in vivo у C. elegans . Действительно, всего через несколько лет после открытия Файером и др . (1998), почти все из 19 000 генов C. elegans были проанализированы с помощью .

Производство библиотек РНКи облегчило применение этой технологии в масштабе всего генома, и методы, основанные на РНКи, стали преобладающим подходом для скринингового нокдауна в масштабе всего генома.

Тем не менее, подходы к нокдаун-скринам на основе РНКи имеют свои ограничения. Во-первых, сильные отклонения от цели вызывают проблемы с ложноположительными наблюдениями. Кроме того, поскольку РНКи снижает экспрессию генов на посттранскрипционном уровне за счет нацеливания на РНК, скрининг на основе РНКи приводит только к частичному и краткосрочному подавлению генов. В то время как частичное нокдаун может быть желательным в определенных ситуациях, требовалась технология с улучшенной эффективностью прицеливания и меньшим количеством попаданий вне цели.

С момента первоначальной идентификации как прокариотическая адаптивная иммунная система, система бактерий типа II, сгруппированных с регулярными интервалами коротких палиндромных повторов (CRISPR) / Cas9 , стала простым и эффективным инструментом для генерации целевых мутаций LOF. Он был успешно применен для редактирования геномов человека и начал вытеснять РНКи как доминирующий инструмент в исследованиях на млекопитающих. В контексте нокаут-скринингов по всему геному недавние исследования продемонстрировали, что экраны CRISPR / Cas9 способны достигать высокоэффективного и полного истощения белка и преодолевать нецелевые проблемы, наблюдаемые при скринингах RNAi. Таким образом, недавнее появление CRISPR-Cas9 резко увеличило наши возможности по выполнению крупномасштабных экранов LOF. Универсальность и программируемость Cas9 в сочетании с низким уровнем шума, высокой эффективностью выбивания и минимальными эффектами вне цели сделали CRISPR платформой выбора для многих исследователей, занимающихся таргетингом и редактированием генов.

Рак

Лекарство от рака человечество ищет со времени греческого врачо Гиппократ, который жил между 460 и 370 г. до н.э., и придумал слово для этой болезни: karkinos. Но поскольку рак, как и многие болезни, является результатом мутации в геноме человека, исследователи говорят, что возможно лечение на основе CRISPR могло бы в один прекрасный день замедлить скорость распространения опухоли или полностью прекратить болезнь.

Некоторая ранняя работа в этой области уже происходит в Китае, где правила, регулирующие использование генного редактирования у людей, более мягкие, чем в Соединенных Штатах.

В октябре 2016 года больной раком легкого в Китае стал первым из 10 человек в мире, получившим инъекцию клеток, модифицированных с использованием CRISPR, сообщает журнал Nature. Исследователи, возглавляемые онкологом доктором Лу Вы в Университете Сычуани в Чэнду, модифицировали иммунные клетки, взятые из собственной крови пациента, и отключили ген, который продуцирует белок, который обычно захватывает раковые клетки, чтобы разделить и размножить. Есть надежда, что без белка раковые клетки не будут размножаться, и иммунная система победит.

Исследовательские группы в Соединенных Штатах также рассматривают способы использования CRISPR для борьбы с раком. Д-р Карл Джун, директор по трансляционным исследованиям в Рак-центре Абрамсона в Университете Пенсильвании, и его коллеги получили одобрение в июне 2016 года от Национального института здоровья для проведения клинического исследования 18 пациентов с раком на поздних стадиях меланомы (рак кожи), саркомой (рак мягких тканей) и множественной миеломой (рак костного мозга), согласно заявлению университета. В этом клиническом испытаним исследователи будут использовать CRISPR для изменения трех генов в собственных клетках иммунной системы пациентов, в надежде получить эти клетки для уничтожения раковых клеток в их телах.